TINCION DE GRAM

OBJETIVOS.

Realizar la Tinción de Gram de una muestra de agua correcta.

FUNDAMENTO:

Diferenciar mediante la Tinción entre las paredes celulares de las bacterias Gram negativa y Gram positiva. Mientras que la pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa depeptidoglicano, además de dos clases de acidos teicoicos , la capa de peptidoglicano  de las Gram negativas es delgada y se encuentra y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior, por medio de lipoproteínas. por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared . La clave es el peptodidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor cantidad que las Gram negativas.

MATERIALES

Cubeta de cristal
Mechero bunsen
Vaso de precipitado
Puente de tinción
Asa de siembra
Pipeta pasteur
Portaobjetos
Papel secante
Agua destilada

REACTIVOS

Cristal violeta
Lugol
Acetona( 30% de acetona y 70% Etanol)
Safranina

PROCEDIMIENTO

1 .Ponemos una cubeta y sobre el un puente de tinción que es sobre lo que vamos a trabajar, siempre poniendo un papel para trabajar.

2. Cogemos un portaobjetos y si es un medio solido añadimos una gota de solución salina si es liquido no hace falta.

3. Cogemos una colonia de la muestra que vamos a tintar y esparcimos por el centro del portaobjetos de forma que quede delimitado por el centro pero bien extendido para evitar grumos.

4. Secamos el contenido del portaobjetos al aire libre o bien mediante una llama en el mechero bunsen teniendo cuidado de no quemar mas la muestra, cuando se seque pasamos 4o 5 veces mas la muestra para fijar los microorganismos.

5. Empezamos la primera tincion con el cristal violeta durante un minuto para que se impregne lo suficiente del tinte, este dará color a las Gram positivas.

6. Lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante , es importante lavar durante 4 o 5 veces siempre quitando todo el exceso posible de tinte hasta que el porta objetos tenga  tenga la zona con la muestra con un tenue color azulado

7. Ahora añadiremos Lugol durante un minuto a la muestra actuara como una laca fijando bien el tinte a las células que lo tengan.

8. Lavar otra vez con agua en exceso para eliminar bien repetir durante 3 o 4 veces mas.

9. Ahora procedemos a utilizar el alcohol- acetona 7 :3 verteremos gota a gota en el portaobjetos inclinado durante unos 40 s

10. Lavar con abundante agua en exceso otra vez pero en este caso para para asegurarnos que se elimina todo el disolvente, es importante este paso.

11. Por ultimo añadiremos la Safranina , que es el segundo colorante que usaremos o colorante de contraste para darle la tinción a las bacterias Gram negativas. Lo haremos durante un minuto.

12. Lavar con abundante agua en exceso.

13. Dejaremos secar la preparación para poder ser utilizada en el microscopio.

14. Examinar la composición de la placa al microscopio, pudiendo ir con el revolver de mas lejano a cercano o rápidamente con el objetivo 100x y aceite de inmersión.

MEDIDAS DE PREVENCION

Nunca utilizar acetona pura porque eliminaría completamente la tinción.
Usar guante a la hora de hacer la tinción.
Presencia de bacilococos en la muestra de color rojo claro.